上期“干货预警——原来基因功能富集分析这么简单！”和“【R语言】——基因GO/KEGG功能富集结果可视化（保姆级教程）”介绍如何使用DAVID在线分析工具对基因进行GO/KEGG功能富集分析和使用R ggplot包对获得的基因GO/KEGG功能富集结果进行可视化。本期介绍使用R clusterProfiler包和R AnnotationHub包对基因进行GO/KEGG功能富集分析、OrgDb包制作以及结果可视化。

GO/KEGG功能富集分析中重要的是背景基因的选择，使用R clusterProfiler包对基因进行富集，需要导入目的基因（前景基因）相对应物种的参考基因组（背景基因），现阶段“bioconductor”已有十几种常见动物，如人类、小鼠等物种的OrgDb。但仍然有许多物种不在Bioconductor的OrgDb列表里，但存在参考基因组，如山羊，绵羊等，这种情况则需要用到R AnnotationHub包进行索引其对应物种的参考基因组，并制作OrgDb包使用。

1 数据准备

数据输入格式（xlsx格式）：

2　R包加载、数据导入及处理

#下载包#
if(!requireNamespace("BiocManager", quietly = TRUE))
  install.packages("BiocManager")
BiocManager::install("clusterProfiler") 
BiocManager::install("topGO") 
BiocManager::install("Rgraphviz") 
BiocManager::install("pathview") 
install.packages("ggplot2")
BiocManager::install('stringr')
install.packages("openxlsx")
#加载包#
library(clusterProfiler)
library(topGO)
library(Rgraphviz)
library(pathview)
library(ggplot2)
library(stringr)
library(openxlsx)
 
#导入数据#
remove(list = ls()) #清除 Global Environment
getwd()  #查看当前工作路径
setwd("C:/Rdata/jc")  #设置需要的工作路径
list.files()  #查看当前工作目录下的文件
data = read.xlsx("enrich-gene.xlsx",sheet= "enrich_genes",sep=',') #导入数据
head(data)

#数据处理-差异基因筛选#
vector = abs(data$log2FC) > 1 & data$PValue < 0.05 & data$gene_name !="" ##abs绝对值;通常logFC> 1和PValue< 0.05条件进行筛选；data$gene_name != ""表示gene_name不为空白
#data$gene_name<-str_to_title(data$gene_name)#用stringr将基因名称的第一个字母大写（小鼠首字母为大写）
data_sgni= data[vector,]#筛选差异基因
head(data_sgni)
#All_gene <- rownames(data) # 提取所有基因基因名

3 背景基因选择及GO/KEGG富集分析

3.1 在“bioconductor”中已有OrgDb的物种的富集分析

在http://bioconductor.org/packages/release/BiocViews.html#___OrgDb 中寻找需要物种的OrgDb（目前仅有下图所示物种），以人类“org.Hs.eg.db”为例：

图1 “bioconductor”中已有OrgDb的物种

#已有OrgDb的常见物种#
BiocManager::install("org.Hs.eg.db") 
library(org.Hs.eg.db)
#基因ID转换#
keytypes(org.Hs.eg.db) #查看所有可转化类型
entrezid_all = mapIds(x = org.Hs.eg.db,  #id转换的比对基因组（背景基因）的物种，以人为例
                      keys = data_sgni$gene_name, #将输入的gene_name列进行数据转换
                      keytype = "SYMBOL", #输入数据的类型
                      column = "ENTREZID")#输出数据的类型
entrezid_all  = na.omit(entrezid_all)  #na省略entrezid_all中不是一一对应的数据情况
entrezid_all = data.frame(entrezid_all) #将entrezid_all变成数据框格式
head(entrezid_all)

###GO富集分析###
GO_enrich = enrichGO(gene = entrezid_all[,1], #表示前景基因，即待富集的基因列表;[,1]表示对entrezid_all数据集的第1列进行处理
                     OrgDb = org.Hs.eg.db, 
                     keyType = "ENTREZID", #输入数据的类型
                     ont = "ALL", #可以输入CC/MF/BP/ALL
                     #universe = 背景数据集 # 表示背景基因，无参的物种选择组装出来的全部unigenes作为背景基因；有参背景基因则不需要。
                     pvalueCutoff = 1,qvalueCutoff = 1, #表示筛选的阈值，阈值设置太严格可导致筛选不到基因。可指定 1 以输出全部
                     readable = T) #是否将基因ID映射到基因名称。
GO_enrich  = data.frame(GO_enrich) #将GO_enrich导成数据框格式
#数据导出#
write.csv(GO_enrich,'C:/Rdata/保存文件/GO_enrich.csv') 

###KEGG富集分析###
KEGG_enrich = enrichKEGG(gene = entrezid_all[,1], #即待富集的基因列表
                         keyType = "kegg",
                         pAdjustMethod = 'fdr',  #指定p值校正方法
                         organism= "human",  #hsa，可根据你自己要研究的物种更改，可在https://www.kegg.jp/brite/br08611中寻找
                         qvalueCutoff = 1, #指定 p 值阈值（可指定 1 以输出全部）
                         pvalueCutoff=1) #指定 q 值阈值（可指定 1 以输出全部）
KEGG_enrich  = data.frame(KEGG_enrich)
write.csv(KEGG_enrich,'C:/Rdata/保存文件/KEGG_enrich.csv') #数据导出

3.2 使用“AnnotationHub”获取在线注释并创建OrgDb对象

如果你所研究的物种不在Bioconductor的OrgDb列表里，但存在参考基因组，如山羊(Capra hircus/goat/chx)，绵羊(sheet/Ovis aries)等，这种情况则需要用到AnnotationHub函数进行索引其对应物种的参考基因组（背景基因），并制作OrgDb包使用。

注意：AnnotationHub包连接的Bioconductor数据库是实时更新的，所以需要用到的时候再在线查询和使用。

###制作可索引到物种的OrgDb包###
#下载和加载包#
BiocManager::install("AnnotationHub") 
BiocManager::install("AnnotationDbi")
BiocManager::install("rtracklayer")
library(AnnotationHub)
library(AnnotationDbi)
library(rtracklayer)
#索引与制作OrgDb#
hub <- AnnotationHub() #建立AnnotationHub对象保存到hub
query(hub, 'Capra hircus')  #查询包含山羊(Capra hircus)的物种信息;结果有物种的各类信息需要进一步筛选
query(hub[hub$rdataclass == "OrgDb"] , "Capra hircus") #筛选我们需要OrgDb类型；也可将上一步与这一步合并成query(hub,'org.Capra hircus')进行搜索
goat <- hub[['AH101444']]  #制作Capra hircus的OrgDb库；AH101444是Capra hircus对应的编号。
goat　#查看goat
#help('select') 

#保存、载入与查看-AnnotationDbi#
saveDb(goat,file="goat.OrgDb") #把goat对象保存成goat.OrgDb文件
goat = loadDb(file="goat.OrgDb") #载入goat.OrgDb文件，保存到goat
length(keys(goat)) #查看包含的基因数量
columns(goat) #查看goat的数据类型
keys(goat, keytype = "SYMBOL") #查看SYMBOL数据集下的ID

# 查看AnnotationHub内容——根据自己兴趣了解#
#display(hub) #调出网页
#unique(hub$species) #查看hub里包含的所有物种
#unique(hub$rdataclass) #查看hub里的数据类型
#hub[hub$rdataclass == "OrgDb"] #查看hub里OrgDb类型的数据

#基因ID转换#
keytypes(goat) #查看所有可转化类型
entrezid_all = mapIds(x = goat,  #id转换的比对基因组（背景基因）所属物种，这边为山羊
                      keys = data_sgni$gene_name, #将输入的gene_name列进行数据转换
                      keytype = "SYMBOL", #输入数据的类型
                      column = "ENTREZID")#输出数据的类型
entrezid_all = na.omit(entrezid_all)  #na省略entrezid_all中不是一一对应的数据情况
entrezid_all = data.frame(entrezid_all) #将entrezid_all变成数据框格式
head(entrezid_all)
#GO富集分析#
GO_enrich = enrichGO(gene = entrezid_all[,1],  #待富集的基因列表
                      OrgDb = goat,  #指定物种的基因数据库，goat直接赋值给OrgDb参数即可
                      keyType = 'ENTREZID',  #输入数据的类型
                      ont = 'ALL',  #可指定 BP\MF\CC\ALL 
                      pAdjustMethod = 'fdr',  #指定 p 值校正方法
                      pvalueCutoff = 1,  #指定 p 值阈值（指定 1 以输出全部）
                      qvalueCutoff = 1,  #指定 q 值阈值（指定 1 以输出全部）
                      readable = FALSE)
GO_enrich = data.frame(GO_enrich)
write.csv(GO_enrich,'C:/Rdata/保存文件/GO_enrich.csv') #数据导出#
###KEGG富集分析###
KEGG_enrich = enrichKEGG(gene = entrezid_all[,1], #即待富集的基因列表
                         keyType = "kegg",
                         pAdjustMethod = 'fdr',  #指定p值校正方法
                         organism= "chx",  #山羊，可根据你自己要研究的物种更改，可在https://www.kegg.jp/brite/br08611中寻找
                         qvalueCutoff = 1, #指定 p 值阈值（可指定 1 以输出全部）
                         pvalueCutoff=1) #指定 q 值阈值（可指定 1 以输出全部）
KEGG_enrich  = data.frame(KEGG_enrich)
write.csv(KEGG_enrich,'C:/Rdata/保存文件/KEGG_enrich.csv') #数据导出

输出的GO/KEGG富集结果各列内容：

ONTOLOGY：GO的BP（生物学过程）、CC（细胞组分）或MF（分子功能）三个方面内容；

ID：富集到的GO term/KEGG term；

Description：对GO term/KEGG term的生物学功能和意义进行描述；

GeneRatio：富集到该GO term/KEGG term中的基因数目/给定基因的总数目；

BgRatio：该GO term/KEGG term中背景基因总数目/该物种所有已知GO功能基因的数目；

pvalue、p.adjust和qvalue：p值、校正后p值和q值；

geneID和Count：富集到该GO term/KEGG term中的基因名称和数目。

4 GO/KEGG富集结果可视化

###GO/KEGG富集结果可视化###
#数据载入与处理#
install.packages("ggplot2")
library(ggplot2)
go_enrich = read.xlsx("enrich-gene.xlsx",sheet= "ONTOLOGY",sep=',')  
go_enrich$term <- paste(go_enrich$ID, go_enrich$Description, sep = ': ') #将ID与Description合并成新的一列
go_enrich$term <- factor(go_enrich$term, levels = go_enrich$term,ordered = T)

#纵向柱状图#
ggplot(go_enrich, 
       aes(x=term,y=Count, fill=ONTOLOGY)) + #x、y轴定义；根据ONTOLOGY填充颜色
  geom_bar(stat="identity", width=0.8) +  #柱状图宽度
  scale_fill_manual(values = c("#6666FF", "#33CC33", "#FF6666") ) +  #柱状图填充颜色
  facet_grid(ONTOLOGY~., scale = 'free_y', space = 'free_y')+
  coord_flip() +  #让柱状图变为纵向
  xlab("GO term") +  #x轴标签
  ylab("Gene_Number") +  #y轴标签
  labs(title = "GO Terms Enrich")+  #设置标题
  theme_bw()
#help(theme) #查阅这个函数其他具体格式

#横向柱状图#
ggplot(go_enrich, 
       aes(x=term,y=Count, fill=ONTOLOGY)) +  #x、y轴定义；根据ONTOLOGY填充颜色
  geom_bar(stat="identity", width=0.8) +  #柱状图宽度
  scale_fill_manual(values = c("#6666FF", "#33CC33", "#FF6666") ) + #柱状图填充颜色
  facet_grid(.~ONTOLOGY, scale = 'free_x', space = 'free_x')+
  xlab("GO term") + #x轴标签
  ylab("Gene_Number") +  #y轴标签
  labs(title = "GO Terms Enrich")+ #设置标题
  theme_bw() + 
  theme(axis.text.x=element_text(family="sans",face = "bold", color="gray50",angle = 70,vjust = 1, hjust = 1 )) #对字体样式、颜色、还有横坐标角度（）

#气泡图#
ggplot(go_enrich,
       aes(y=term,x=Count))+
  geom_point(aes(size=Count,color=p.adjust))+
  facet_grid(ONTOLOGY~., scale = 'free_y', space = 'free_y')+
  scale_color_gradient(low = "red",high ="blue")+
  labs(color=expression(PValue,size="Count"), 
       x="Gene Ratio",y="GO term",title="GO Enrichment")+
  theme_bw()

图1 为GO富集结果图

KEGG富集结果与GO富集结果可视化类似可参考上一期“【R语言】——基因GO/KEGG功能富集结果可视化（保姆级教程）”内容。

好了本次分享就到这里，下期有更精彩内容，敬请期待。

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